Kapitola 9. Diagnostika syfilis - sérologie

Poznámka

Tato kapitola obsahuje mimo jiné několik přehledných návodů ke zhotovení sérologických reakcí rutinně používaných v diagnostice syfilis. V různých laboratořích mohou existovat podle typu používaných souprav i dalších zvyklostí významné odlišnosti. Doporučujeme proto chápat návody spíše jako určitý druh "ilustrace" k uvedeným principům. Vyplatí se vždy pečlivě prostudovat příbalové letáky jednotlivých souprav.

Smyslem této kapitoly není v žádném případě doporučovat konkrétní výrobky. S diagnostickými soupravami uvedenými v této kapitole jsme pracovali v letech 2003 - 2007, kdy se pořizovala dokumentace pro tuto práci. Některé z nich se už v sérologické laboratoři Mikrobiologického ústavu LF MU nepoužívají.

Sérologická diagnostika je stěžejním nástrojem v diagnostice syfilis. Reakce užívané v sérologii syfilis můžeme rozdělit na dvě skupiny podle povahy použitého antigenu. Jsou to reakce netreponemové (nespecifické) a reakce treponemové (specifické). U reakcí specifických se používá přímo antigen T. p. pallidum, u nespecifických kardiolipin, což je fosfolipid tvořící součást buněčných membrán. Nespecifické protilátky po účinné léčbě během týdnů až měsíců vymizí, ale specifické IgG zůstávají detekovatelné dlouhodobě.

Z historie vyšetřování syfilis

Sérologické reakce

V roce 1906 zavedli Wassermann, Neisser a Bruck do diagnostiky příjice komplementfixační reakci (BWR), při které adaptovali test, který vymysleli roku 1901 Bordet a Gengou. V roce1922 připravil Kahn flokulační reakci bez komplementu, která se dala odečítat makroskopicky během několika hodin. Tyto nespecifické testy, nebo jejich modifikace, byly až do objevu imobilizačního testu (TPIT) jedinými nástroji v sérologické diagnostice syfilis (Pospíšil 1981). Historický vývoj nespecifických testů podrobně mapují práce Larsenové (1995) a Pospíšila (1981).

TPIT čili Nelsonův-Mayerův Treponema pallidum imobilizační test měl v sérologii příjice zvláštní postavení (Pospíšil 1981). Byl ve své době "uctívanou" reakcí, ale na konci své éry byl naopak možná nejzatracovanějším sérologickým testem. Sledoval se v něm mikroskopicky vliv pacientova séra na živá treponemata. Diagnostický význam TPIT klesl pro stále častěji pozorované interferující biologické vlivy, především toxické účinky testovaných sér na treponemata. Pro tuto reakci bylo nutné pasážovat T. p. pallidum na králičích varlatech, ale tento postup nedával vždy dostatečný výnos treponemat vyžadovaný pro reakci. Dnes se TPIT nepoužívá.

Jako první popsal neutralizaci, která je vlastně principem TPIT, Eberson (1921). Zkoumal v ní na králících životaschopnost spirochét inkubovaných se sérem pacienta. Turner (1939,1948) doplnil Ebersonova zjištění a metodiku tím, že vyzkoušel místo intratestikulární inokulace intradermální podání treponemat, což byla modifikace, která umožnila srovnávat vliv odlišných sér. Zjistil, že inkubace treponemat s lidským nebo králičím sérem oslabila nebo dokonce znemožnila vznik lézí po intradermální inokulaci. Nelson (1949, 1951) rozvedl tato zjištění v TPIT, v němž se užíval morčecí komplement. To, že jsou IgG odpovědné za treponemicidní aktivitu závislou na komplementu ale nebylo vlastně prokázáno až do 80. let (Blanco 1984).

Nelson a Mayer (1949) předpokládali, že neutralizující protilátky zachycované v jejich testu zprostředkovávají protektivní munitu. Ukázalo se však, že králíci imunizovaní usmrcenou T. p. pallidum reagují v TPIT také, ale nejsou chráněni při inokulaci nízkých dávek T. p. pallidum intradermálně (McLeod 1953, 1973). Navíc existuje zřetelný rozpor mezi vysokými titry TPIT typicky pozorovanými u sekundární syfilis a faktem že infekční agens volně cirkuluje v krvi během této fáze infekce (Turner 1969, Musher 1976).

V 60. letech minulého století se objevila jedna ze stálic sérologie syfilis - reakce TPHA, dodnes využívaná ke screeningu příjice. V 70. letech se do sérologického armamentaria dostala reakce IgM-FTA. Navázala na objev, který zveřejnil Coons v roce 1942 a ve kterém popsal způsob konjugace fluoresceinú s protilátkou a fluorescenční reakci v ultrafialovém světle mikroskopu (Pospíšil 1981). Následoval rychlý rozvoj dalších metod, nástup reakcí typu ELISA zhruba v 80. letech minulého století a ještě později westernblotu nebo imunochromatografických testů.

Buď jak buď, přes zásadní význam treponemových testů v moderní diagnostice syfilis, význam flokulačních reakcí, kterými sérologie začala s bojem proti syfilis, trvá. Jsou živou připomínkou umu generace mikrobiologů - "klasiků".

Přínos Mikrobiologického ústavu LF MU

Mikrobiologický ústavu LF MU LF MU a FN u sv. Anny v Brně se věnuje vyšetřování syfilis již od svého vzniku. Dvě osobnosti však vynikly v této oblasti nad jiné. Byli to prof. Václav Tomášek a jeho žák, prof. Leopold Pospíšil.

Profesor Václav Tomášek

Prof. MUDr. Václav Tomášek, DrSc. (30. 11. 1893 - 20. 6. 1962) byl přední osobností československé lékařské mikrobiologie a po dvě období také děkanem LF MU.

Od roku 1920 působil na Patologicko-anatomickém ústavu Masarykovy univerzity v Brně, nejprve jako asistent prof. Kučery, pak prof. Neumanna. Od samého začátku se zaměřil na mikrobiologii, vedl praktickou výuku, a to i pro Mikrobiologický ústav prof. Kabelíka. Byl prvním habilitovaným docentem lékařské mikrobiologie na LF MU (1928) a prvním přednostou samostatného Mikrobiologického ústavu (1936).

Prof. Tomášek se zabýval hlavně sérologickou diagnostikou syfilidy. K průkazu antikardiolipinových protilátek se dlouho používal jím vyvinutý Tomáškův antigen. V roce 1938 vydal v Melantrichu v edici Vysokoškolské rukověti moderně pojatou a přehlednou Bakteriologii.

Prof. Kabelík ve své "Nauce o sérových protilátkách" popisuje přípravu tzv. Tomáškova antigenu ze séra rozloženého pseudomonádou a mimo to cituje Tomáškovu přehlednou práci o luetických reaginech v 1. čísle Časopisu Lékařů českých z r. 1928. Dle Kabelíka práce obsahuje 757 citací (!). Další Tomáškovou prací spojenou se sérologií syfilis je "Studie o antigenním účinku lipoidů užívaných k BWR", která vyšla v roce 1931, v čísle 2, ve Spisech lékařské fakulty v Brně. Za tuto práci byl v témže roce prof. Tomášek vyznamenán Hlavovou cenou Spolku českých lékařů v Praze.

Obrázek 9.1. Prof. Václav Tomášek

Prof. Václav Tomášek


V prosinci1936 převzal prof. Václav Tomášek po prof. Kabelíkovi vedení Mikrobiologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a 5. 9. 1939 byl jmenován řádným profesorem mikrobiologie.

Za okupace byl prof. Tomášek zatčen a internován v Osvětimi. Po válce byl pověřen ještě vedením fakultních hygienických ústavů v Brně a v Olomouci. Válečné útrapy však podryly jeho zdraví, a tak odchází předčasně v roce 1960 do důchodu. V roce 1962 v rodných Koryčanech umírá.

Za statečnost v době dlouholeté internace byl profesor Václav Tomášek vyznamenán Československým válečným křížem. Vyznamenáním, jímž se, jak vzpomíná prof. Pospíšil, ve své skromnosti nikdy nezdobil (Pospíšil 2004).

Tomáškův antigen

Na 5 - 10 koagulovaných krevních sér se naočkuje Pseudomonas aeruginosa a inkubuje se 5 - 7 dní v termostatu při 37°C. Zkapalněný obsah zkumavek se vylije na plochou porcelánovou misku a usuší v termostatu. Suchý zbytek se spráší, odváží a na 1g se nalije 40 cm3 absolutního alkoholu. Extrahuje se v dobře zazátkované láhvi v termostatu při 37°C 10 dní, směs se několikrát denně protřepe. Alkoholový extrakt se potom přefiltruje a uchovává se v hnědé láhvi při pokojové teplotě (citace z ručně psaných záznamů uchovaných na MÚ LF MU).

Profesor Leopold Pospíšil

Prof. MUDr. et MVDr. h. c. Leopold Pospíšil, DrSc. (10. 3. 1925 - 1. 2. 2005) pracoval v letech 1952 - 1956 pod vedením prof. Tomáška na Mikrobiologickém ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Poté na I. dermatovenerologické klinice prof. Trýba vybudoval a do roku 1990 vedl mikrobiologickou a sérologickou laboratoř orientovanou také na diagnostiku sexuálně přenosných infekcí. V roce 1965 se stal docentem a v roce 1984 profesorem.

V letech 1990 - 1993 byl prof. Pospíšil přednostou Mikrobiologického ústavu LF MU. Za jeho šéfování panoval na Mikrobiologickém ústavu čilý ruch, a to ve všech směrech. Prof. Pospíšil položil například základ každoroční konferenci mladých mikrobiologů nazvaných podle jeho učitele Tomáškovy dny. Dnes na ní mimo jiné pravidelně zaznívají práce v oblasti výzkumu T. pallidum prezentované týmem kolem doc. Šmajse. Po odchodu z Mikrobiologického ústavu prof. Pospíšil působil jako vedoucí vědecký pracovník ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství v Brně - Medlánkách a věnoval se hlavně výzkumu chlamydií (Votava 2000).

Z Pospíšilových monografií vyniká "Sérologické vyšetřování syfilis a klinická interpretace výsledků" (1981) jako velmi podrobná a v českém písemnictví v podstatě ojedinělá publikace. S trochou nadsázky můžeme říci, že je to dobová "bible sérologie syfilis". Profesor Pospíšil na toto téma publikoval v 60. - 80. letech také sérii článků, které patří k nejvýznamnější části jeho rozsáhlé a pestré (asi 400 položek čítající) bibliografie. Věnoval se v nich například úskalím FTA-testu, TPHA, fenoménu imobilizace, nebo metodice ELISA v diagnostice příjice (Pospíšil 1976, 1978, 1983). Těžko bychom u nás hledali jiného mikrobiologa, který se tak cílevědomě věnoval samotné interpretaci a porovnávání testů pro diagnostiku syfilis.

I když monografie z roku 1981 věnuje pochopitelně ještě značný prostor metodice TPIT, prof. Pospíšil nikdy neulpíval na minulém. Pro vzpomínku uchovává sérologická laboratoř MÚ LF MU rukou psaný dopis pana profesora z poloviny devadesátých let, kde nás nabádá, abychom věnovali větší pozornost testům ELISA a nebáli se trochu experimentovat s Elisou založenou na TmpA. Činorodost spojená s určitým druhem odvahy a touhou objevovat nové je asi to, co se prof. Pospíšil snažil v nováčcích oboru lékařská mikrobiologie pěstovat.

Obrázek 9.2. Prof. Leopold Pospíšil

Prof. Leopold Pospíšil

Obrázek 9.3. Monografie prof. Pospíšila a J. Horáčka (1981)

Monografie prof. Pospíšila a J. Horáčka (1981)