Reakce netreponemové

Netreponemové reakce se používají v kombinaci s treponemovými testy ke screeningu syfilis, k posouzení aktivity choroby a úspěšnosti léčby. Jsou však zatíženy 2 - 10 % falešně pozitivních výsledků a také falešně negativních reakcí (u pozdní latentní syfilis až 30 % reakcí) (Zákoucká 2001).

Netreponemové testy zahrnují průkaz nespecifických antikardiolipinových protilátek v různých formátech, jako jsou RRR (rychlá reaginová reakce), RPR (rapid plasma reagin), či reakce označovaná jako VDRL (Venereal Disease Research Laboratory).

VDRL je flokulační (precipitační) test na sklíčku a zároveň jediný standarizovaný test doporučený WHO pro vyšetření likvoru. Je metodou volby pro vyšetřování neurosyfilis (Wicher 1999). Existují také testy s VDRL antigenem ve formátu ELISA. Metoda ELISA je všeobecně citlivější než flokulační testy, což platí i pro diagnostiku syfilis (Wicher 1999).

RRR je obdobou VDRL, podobně jako RPR, kde je odečítání reakce vylepšeno o makroskopickou vizualizaci pomocí karbonových částic, nebo pigmentů.

Při odečítání netreponemových reakcí se můžeme setkat se specifickým úskalím, tzv. zonálním fenoménem. Jako zonální fenomén, nebo také fenomén prozóny, se označuje situace, kdy u sér s vysokým titrem protilátek (u akutní syfilis) vzniká s neředěným sérem falešně negativní reakce a teprve se stoupajícím ředěním dochází k rozvoji pozitivní reakce (Zákoucká 2001). Proto není vhodné používat netreponemový (zejména neředěný) test jako jedinou vyhledávací reakci, i když frekvence tohoto fenoménu je asi jen 1 - 2 % (Wicher 1999).

Dnešní netreponemové reakce jsou modifikacemi původní Wassermanovy reakce (BWR). Kardiolipinový antigen, který se používá v průkazu nespecifických protilátek, není vlastně pouhý kardiolipin, ale směs lecitinu, cholesterolu a purifikovaného kardiolipinu. Cholesterol zvyšuje citlivost reakce, ale ne její specificitu. Citlivost kardiolipinu byla ještě vystupňována v preparátu zvaném kardiolipin pro flokulační reakci (Pospíšil 1981). Rozdělení netreponemových testů, jejich modifikace a použití byly popsány detailně v četných pracech u nás i v zahraniční ( Larsen 1995, Larsen 1998, Singh 1999, Wicher 1999, Young 1992, Woznicová 2003, Zákoucká 2001)

Rychlá reaginová rekce (RRR)

Reakci popsali v roce 1957 Portnoy, Garson a Smith. Jako antigen použili emulzi VDRL resuspendovanou v 10% cholinchloridu ve fyziologickém roztoku (Pospíšil 1981).

Princip reakce

Principem reakce je precipitace kardiolipinového antigenu protilátkami v pacientově séru. Precipitace je viditelná pouhým okem. Metoda slouží ke stanovení protilátek v séru nebo mozkomíšním moku pacienta a hodí se ke sledování úspěšnosti léčby .

Chemikálie a spotřební materiál

K provedení testu jsou potřeba tyto chemikálie:

  1. kardiolipinový antigen VDRL o složení: roztok v bezvodém etanolu – kardiolipin 0,03 %, lecitin 0,3 %, cholesterol 0,9 %

  2. pozitivní kontrolní králičí sérum

  3. pufr o pH 6

  4. ethylendiaminotetraacetát sodný (chelaton 3)

  5. cholinchlorid (cholinum chloratum)

  6. merthiolát s pufrem o pH 6,9

  7. veronalový pufr

  8. destilovaná voda

Spotřební materiál: panel pro RRR, sérologické špičky

Obrázek 9.5. Panel pro RRR

Panel pro RRR

Obrázek 9.6. Panel pro RRR (pohled shora)

Panel pro RRR (pohled shora)

Obrázek 9.7. Sérologické špičky

špičky sérologickéSérologické špičky

 

Příprava a uchovávání roztoků a reagencií
  1. Pufrovaný roztok NaCl o pH 6,0: neutrální formaldehyd 0,500 g, Na2HPO4.12H2O 0,093 g, KH2PO4 0,170 g, NaCl 10,000 g, destilovaná voda ad 1000,0 ml

  2. Kardiolipin pro VDRL

  3. Ethylendiaminotetraacetát sodný (chelaton 3): EDTA Na 3,72 g, destilovaná voda 100 ml

  4. Cholinchlorid(cholinum chloratum): cholinchlorid krystalický 40,0 g, destilovaná voda 100 ml

  5. Merthiolát s pufrem:Na2HPO4.12H2O 0,284 g, KH2PO4 0,272 g, merthiolát 0,200 g, destilovaná voda 100 ml

  6. Veronalový pufr, zásobní roztok: Na-dihydrobarbiturát, sodná sůl 1,875 g, kyselina diethylbarbiturová 2,875 g, NaCl 42,5 g, MgCl2.6H2O 0,840 g, CaCl2.2H2O 0,140 g, destilovaná voda 1000 ml

Nejprve rozpustíme kyselinu diethylbarbiturovou, pak přidáme ostatní složky. pH upravujeme na 7,3 až 7,4 jednomolární HCl nebo NaOH. Zásobní roztok uchováváme v ledničce, pro stanovení jej ředíme 4 díly destilované vody.

Uchovávání roztoků: Roztoky zfiltrujeme přes filtrační papír a uchováváme je při pokojové teplotě. Před použitím je prohlédneme, zda nejsou zkalené a používáme vždy jen dokonale čiré roztoky. Zkalený cholinchlorid je ale možné přefiltrovat a znovu použít.

 

Příprava antigenní emulze

Na dno Erlenmayerovy baňky se nakape 4,0 ml pufrovaného roztoku NaCl a za stálého míchání se po kapkách přidá 5,0 ml antigenu. Směs se míchá asi 10 s a přidá se 41,0 ml pufrovaného roztoku NaCl.

Centrifuguje se při 10 tisících otáčkách/min. po 30 minut. Supernatant se vylije, sediment se mechanicky rozruší a vytvoří se suspenze sedimentu se směsí následujících roztoků: EDTA 6,1 ml, cholinchlorid 12,5 ml, merthiolát 25,0 ml, destilovaná voda 6,1 ml.

Hotový antigen se skladuje v ledničce (při 4 °C) maximálně 8 týdnů.

 

Přístroje a pomocná zařízení

Nezbytnými zařízeními jsou třepačka na mikrotitrační panely, sérologická pipeta, kapátko 50 μl a dávkovač.

 

Obrázek 9.8. Třepačka na mikrotitrační panely

Třepačka na mikrotitrační panely

Obrázek 9.9. Sérologická pipeta (na kónus se nasadí plastová špička)

Sérologická pipeta (na kónus se nasadí plastová špička)

Obrázek 9.10. Kapátko 50 μl

Kapátko 50 μl

Obrázek 9.11. Dávkovač

Dávkovač

Obrázek 9.12. Dávkovač v bočním pohledu

Dávkovač v bočním pohledu

Provedení RRR

Do jamky panelu se napipetuje 0,05 ml testovaného séra a 0,05 ml (2 kapky) antigenní emulze o teplotě 20 - 24 °C. Současně se připraví pozitivní kontrola. Sérum s antigenem se protřepává 5 minut na třepačce.

Obrázek 9.13. Laborantka dávkuje antigenní emulzi s kardiolipinem do panelu

Laborantka dávkuje antigenní emulzi s kardiolipinem do panelu

Odečet výsledků

Odečet RRR je možný pouhým okem, nebo při 4-násobném zvětšení. Jako pozitivní výsledek se hodnotí nález shluků jehličkovitých částic. V důlku s pozitivní kontrolou musí být vždy přítomna precipitace (flokulace). U sér obsahujících antikardiolipinové protilátek se stanoví jejich titr. Séra se titrují s počátečním ředěním 1:2. Pro titraci se ředí veronalovým pufrem nebo destilovanou vodou.

Obrázek 9.14. Odečítání RRR, vpravo precipitace - jamka s pozitivní kontrolou

Odečítání RRR, vpravo precipitace - jamka s RRR - pozitivní kontrolapozitivní kontrolou

Obrázek 9.15. Shluky kardiolipinu (precipitáty) při 4-násobném zvětšení

precipitátyShluky kardiolipinu (precipitáty) při 4-násobném zvětšení

Obrázek 9.16. RRR - negativní kontrola při 4-násobném zvětšení

RRR - negativní kontrola při 4-násobném zvětšení