Reakce treponemové

Treponemové reakce můžeme rozdělit na reakce vyhledávací a konfirmační. Reaktivita ve vyhledávacích testech se musí potvrdit testy konfirmačními.

Vyhledávacími reakcemi jsou TPHA, TPPA, ELISA (EIA) stanovující celkové, nebo IgG protilátky, případně imunochromatografické testy.

Pro konfirmaci syfilis slouží FTA-ABS, FTA-ABS IgM, 19S IgM FTA-ABS, westernblot IgM a IgG, 19S IgM SPHA a immunoline assay IgG (Zákoucká 2007).

TPHA (MHA-TP)

TPHA (T. pallidum hemagglutination) je pro svou jednoduchost, citlivost a příznivou cenu typickým screeningovým testem (Woznicová 2007, Zákoucká 2007). Při sérokonverzi je to jedna z prvních pozitivních séroreakcí. Citlivost TPHA u primární syfilis je 69 - 90 %, u sekundární syfilis 100 % a později kolem 97 %. Specificita je nejméně 98 % (Larsen 1995).

Ačkoliv se někdy uvádí, že pozitivita TPHA se objevuje později než u kardiolipinových testů, zhruba třetí až čtvrtý týden po začátku infekce (Young 1992), podle zkušeností sérologické laboratoře Mikrobiologického ústavu se v praxi častěji vidí opačná situace. Anderson (1989) v rozsáhlé retrospektivní studii zjistil, že citlivost TPHA u primární infekce je 74,9 %, zatímco citlivost VDRL ve stejné situaci je 70,4 %.

Kvantifikace protilátkové odpovědi u TPHA nemá na rozdíl od netreponemových testů význam, protože TPHA neodráží aktivitu infekce a je tedy spíše "sérologickou jizvou", která přetrvává dlouhodobě i po adekvátní léčbě. Pasivní hemaglutinace zůstává někdy jedním z mála validních svědectví o infekci T. p. pallidum v minulosti (Larsen 1995, Woznicová 2007). U časné léčené syfilis nastává negativizace poměrně zřídka a u případů léčené pozdní syfilis zůstává TPHA obvykle pozitivní (Pospíšil 1981, Woznicová 2007).

Terminologická poznámka - název TPHA se dříve používal pro zkumavkovou variantu testu a MHA-TP (mikrohemaglutinace T. pallidum) pro variantu v mikrotitračních destičkách. Dnes je v odborné literatuře malý zmatek v těchto označeních. Už roky se v sérologii používají mikrotitrační postupy a zkumavková varianta hemaglutinace se nedělá. Pojem TPHA proto evropští autoři používají většinou místo MHA-TP, což je označení zavedené spíše v amerických studiích. Jsou to tedy v podstatě synonyma (Wicher 1999).

Princip reakce

V TPHA reagují specifické protilátky vzniklé při syfilis s antigenem Nicholsova kmene T. p. pallidum naneseným na krůtích erytrocytech. Sérum obsahující protilátky proti treponematům aglutinuje (shlukuje) červené krvinky za vzniku typického povláčku erytrocytů - aglutinátu. Reakce je pěkným příkladem aglutinace na nosičích (tuto roli zde hrají právě erytrocyty).

Chemikálie a spotřební materiál

Obvykle jsou všechny potřebné chemikálie součástí setu.

Spotřební materiál nutný k provedení reakce představují kapátka o objemu 75 μl (obvykle v soupravě) a mikrotitrační destičky

 

Obrázek 9.17. Souprava pro TPHA: zleva ředící roztok, negativní a pozitivní kontrola, kontrolní a testovací erytrocyty

Souprava pro TPHA: zleva ředící roztok, negativní a pozitivní kontrola, kontrolní a testovací erytrocyty

Přístroje a pomocná zařízení

Pro zhotovení TPHA laboratoř potřebuje třepačku na mikrotitrační destičky, ředící hřeben a stolní centrifugu.

Obrázek 9.18. Ředící hřeben používaný ke zhotovení TPHA

Ředící hřeben používaný ke zhotovení TPHA

Obrázek 9.19. Detail hlavy ředícího hřebene

Detail hlavy ředícího hřebene

Provedení TPHA

  1. Příprava kontrol

    Kontroly pro TPHA připravíme tak, že do jamek mikrotitrační destičky A1 - A4, B1 - B4 napipetujeme po 25 ul ředícího roztoku (oranžové barvy).

    Do jamky A1 napipetujeme 25 μl z lahvičky označené pozitivní kontrola (ze soupravy, zde 1:20).

    Do jamky B1 napipetujeme 25 μl z lahvičky označené negativní kontrola (ze soupravy).

    Naředíme hřebenem obě kontroly postupně z 1. do 2., 3. a 4. důlku, čímž získáme konečné ředění 1:160 až 1: 1280

    Obrázek 9.20. TPHA - laborantka dávkuje ředící roztok

    TPHA - laborantka dávkuje ředící roztok

    Obrázek 9.21. TPHA - pozitivní kontrola (s červeným vrškem) a negativní kontrola

    TPHA - pozitivní kontrola (s červeným vrškem) a negativní kontrola

    Obrázek 9.22. TPHA - laborantka pipetuje pozitivní kontrolu

    TPHA - laborantka pipetuje pozitivní kontrolu

  2. Příprava testovaných sér

    Séra pacientů naředíme takto: Do jamek C1, C3 a C4 napipetujeme po 25 μl ředícího roztoku, do C2 100 μl (4x 25 μl). Použijeme vždy jeden řádek pro sérum jednoho pacienta. Do jamek 1 - 4 v dalších řádcích pipetujeme vždy stejné objemy jako do řádku C.

    Obrázek 9.23. TPHA - laborantka pipetuje do destičky séra

    TPHA - laborantka pipetuje do destičky séra

    Do jamky C1, D1 a dalších (ve sloupci 1) napipetujeme postupně po 25 μl séra pacientů. Séra pacientů naředíme hřebenem postupně z 1. do 2. a 3. důlku. Pak osušíme hřeben a ředíme opět ze 2. do 4. důlku, čímž získáme ve 3 a 4 sloupci séra naředěná 1:80.

  3. Dokončení reakce - vlastní test

    Testovací erytrocyty jsou v kapací lahvičce s červeným vrškem a nesou antigeny T. p. pallidum. Kontrolní erytrocyty (v lahvičce s bílým vrškem) slouží k odlišení falešně pozitivních sér, která reagují se samotnými krůtími erytrocyty.

    K dokončení reakce přidáme erytrocyty ze soupravy takto:

    Testovací krvinky - kapátkem ze soupravy přidáme po 75 μl do řádků A a B v dalších řádcích do všech jamek sloupce 4.

    Kontrolní krvinky - do všech jamek ve sloupci 3 (kromě řádků A a B, kde jsou kontroly).

    Protřepeme na třepačce a po inkubaci při laboratorní teplotě odečítáme za 45 až 60 minut.

    Obrázek 9.24. TPHA - testovací erytrocyty a kontrolní erytrocyty v kapacích lahvičkách (testovací nesou červený vršek)

    TPHA - testovací erytrocyty a kontrolní erytrocyty v kapacích lahvičkách (testovací nesou červený vršek)

Odečítání výsledků

Pozitivním výsledkem TPHA je aglutinace, která se projeví jako povlak na dně jamky s testovacími erytrocyty (ve 4. sloupci mikrotitrační destičky). Při slabší intenzitě reakce erytrocyty formují charakteristický prstenec. Intenzita TPHA se semikvantitativně hodnotí na křížky, tedy jako hraniční (+-) až +++. Kritériem je srovnání s intenzitou pozitivní reakce u ředěného kontrolního séra (Woznicová 2001). Jako pozitivní výsledek se hodnotí aglutinace pouze ve 4. sloupci mikrotitrační destičky. Negativní výsledek je malý (asi 2 mm) ohraničený terčík sedimentovaných erytrocytů. Aglutinát se poměrně snadno roztřepe a reakce se tím znehodnotí, proto je nutné s destičkou zacházet jemně.

Obrázek 9.25. Vzhled aglutinace v reakci TPHA při různé intenzitě protilátkové odpovědi

Vzhled aglutinace v reakci TPHA při různé intenzitě protilátkové odpovědi

Pozitivní kontrola v soupravě bývá nastavena na titr 1:1280. Objeví-li se také aglutinace s kontrolními erytrocyty ve 3. sloupci destičky, reakci nelze hodnotit, protože pacient má protilátky proti samotným krůtím erytrocytům. Může proto vykazovat falešně pozitivní reakci s testovacími erytrocyty.

Obrázek 9.26. TPHA - destička s hotovou reakcí

TPHA - destička s hotovou reakcí

Obrázek 9.27. TPHA - detail uspořádání kontrol a vzorků

TPHA - detail uspořádání kontrol a vzorků

Obrázek 9.28. TPHA - různá intenzita reakce (v červených kroužcích)

TPHA - různá intenzita reakce (v červených kroužcích)


 

 

FTA-ABS

FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody – absorbed) je dobrým nástrojem sérodiagnostiky už na samém počátku syfilis, zhruba od 2. - 3. týdne onemocnění (Young 1992). FTA-ABS je velmi citlivá reakce, u primární syfilis je její citlivost 70 - 100 %, u sekundární a u latentní syfilis 100 %, u terciární asi 96 % (Larsen 1995). Specificita je o něco menší, než u TPHA, asi 97 %.

Hodnocení imunofluorescenční reakce je subjektivní a vyžaduje určitou zkušenost hodnotícího. Nezbytnou pomůckou k odečítání reakce je fluorescenční mikroskop. Imunofluorescenčně mohou být stanoveny také izolovaně protilátky IgM, nabo frakce IgM (v reakci 19S IgM FTA-ABS).

FTA-ABS vyžaduje odstranění rušivých, méně specifických protilátek (například vzniklých na popud nepatogenních treponemat, nebo jiných spirochét), které mají schopnost do reakce vstupovat, ale se syfilis nesouvisejí (Larsen 1998). K tomu se používá tzv. sorbent (antigen připravený z T. phagedenis), kterým se sérum pacienta před reakcí ošetří - vysytí, tedy odstraní se zkříženě reagující protilátky. Marangoniová (2005) prokázala, že T. denticola není příčinou falešně pozitivních treponemálních reakcí v ELISA, ani ve westernblotu. Naopak typickou příčinou falešných pozitivit u FTA-ABS je systémový lupus erythematosus. Příčina falešné pozitivity ale není vždy jasná a ani použití sorbentu jí nemusí zabránit (Hunter 1986).

Princip reakce

Specifické IgG a IgM se váží na antigeny Nicholsova kmene T. p. pallidum, kterým je potaženo speciální podložní sklíčko. Tam, kde protilátky reagují s treponematy, se v závěru reakce objeví žlutozelené světélkování. Podstatou této vizualizace je vazba protilátky spojené s fluorescenčním barvivem (tzv. FITC konjugátu) na pacientovy imunoglobuliny.

Chemikálie a spotřební materiál

Chemikálie potřebné pro vyšetření jsou obsaženy v diagnostické soupravě, jejíž složení bývá následující:

  1. podložní sklíčko s navázaným antigenem T. pallidum

  2. Ultrasorbent (lyofilizovaný) - extrakt nepatogenní T. phagedenis (tzv. Reiterovo treponema)

  3. Pozitivní kontrola (sérum s antitreponemovými protilátkami), lyofilizovaná

  4. Nespecificky pozitivní kontrola (lyofilizovaná)

  5. Konjugát FITC (koncentrovaný)

  6. Fosfátový pufr (PBS) (koncentrovaný)

  7. Krycí pufr (médium)

  8. Negativní kontrola (sérum bez antitreponemových protilátek) (lyofilizovaná)

    Obrázek 9.29. Podložní sklo potažené T. pallidum

    Podložní sklo potažené T. pallidum


Obrázek 9.30. Součásti soupravy pro zhotovení FTA-ABS

Součásti soupravy pro zhotovení FTA-ABS

Zacházení s chemikáliemi má svá pravidla: Lyofilizované chemikálie se skladují při 2 až 8 °C; sklíčka, kontroly, konjugát a ultrasorbent se po otevření uchovávají při – 20 °C a užívají se výhradně do data exspirace, které se zaznamenává v pracovním listě. Všechny součásti reakce se před použitím temperují, tedy ponechají asi 60 minut při pokojové teplotě (20 až 25 °C).

Spotřební materiál není součástí soupravy. Jsou to hlavně jednorázové plastové špičky k pipetám, zkumavky, ochranné rukavice, filtrační papír, lihový fix a krycí sklíčka.

 

Přístroje a pomocná zařízení

K odečítání reakce je nutný fluorescenční mikroskop. Materiál se pipetuje pipetami o objemech 10 μl, 50 μl a 200 μl. Drobnými nezbytnostmi jsou laboratorní minutky a tzv. vlhká komůrka. Ta zajišťuje dostatečnou vlhkost prostředí při inkubování reakce. Je to plastová krabice, kterou lze dobře uzavřít a do které se vkládá navlhčený filtrační papír.

 

Obrázek 9.31. Vlhká komůrka chrání sklíčko při inkubaci před vyschnutím

Vlhká komůrka chrání sklíčko při inkubaci před vyschnutím

 

Provedení FTA-ABS

  1. Příprava reagencií

    Sklíčko před použitím propláchněte destilovanou vodou. Ultrasorbent (lyofilizát) rozřeďte 5 ml sterilní destilované vody. Konjugát (lyofilizát) nařeďte 1 ml sterilní destilované vody. Kontroly nařeďte 1 ml sterilní destilované vody. U PBS nařeďte 1 část koncentrátu s 9 částmi sterilní destilované vody. Pufrovaný glycerol připravte jako směs 10 dílů glycerolu a 1 dílu roztoku PBS.

  2. Příprava séra a kontrol

    Sérum připravujeme v mikrotitrační destičce, u některých setů ve zkumavce.

    1. Sérum nařeďte v panelu ultrasorbentem v poměru 1:5, dle potřeby řeďte s koeficientem 2

    2. Pozitivní kontrolní sérum zřeďte 1 : 5 sorbentem a 1:5 PBS (tj. přidejte 0,05 ml kontroly + 0,20 ml sorbentu nebo PBS). Nespecifické kontrolní pozitivní sérum zřeďte 1:5 sorbentem a 1:5 PBS (tj. přidejte 0,05 ml kontroly + 0,20 ml sorbentu nebo PBS).

    3. Inkubujte směs 30 min. při 37°C

  3. Vlastní provedení testu

    - Propláchněte sklíčka v destilované vodě a před použitím osušte

    - Napipetujte 10 μl každého ředění séra a kontrol do jamek (kroužků) s antigenem, jamka musí být pokryta tekutinou

     

    Obrázek 9.32. FTA-ABS - laborantka pečlivě pipetuje sérum předinkubované se sorbentem

    FTA-ABS - laborantka pečlivě pipetuje sérum předinkubované se sorbentem

    Obrázek 9.33. FTA-ABS - pipetování sér na sklíčko - co kroužek, to vzorek

    FTA-ABS - pipetování sér na sklíčko - co kroužek, to vzorek

     

    - Připravte kontrolu sorbentu: pro 1. fázi inkubace kápněte do jednoho kroužku místo séra SORBENT

    - Připravte kontrolu konjugátu: pro 1. fázi inkubace kápněte do jednoho kroužku místo séra PBS

    - Inkubujte 30 min. při 37 °C v předehřáté vlhké komůrce

    - Opatrně propláchněte v PBS a umístěte na 2 min. do roztoku PBS, pak propláchněte destilovanou vodou

    - Osušte při pokojové teplotě či filtračním papírem a aplikujte do každé jamky 10 μl konjugátu

    - Inkubujte 30 min. při 37 °C v předehřáté vlhké komůrce

    - Opatrně propláchněte v PBS a umístěte na 2 min. do roztoku PBS, pak propláchněte destilovanou vodou

    Obrázek 9.34. FTA-ABS - laborantka noří sklíčko do destilované vody v kyvetě

    FTA-ABS - laborantka noří sklíčko do destilované vody v kyvetě

    Obrázek 9.35. Sklíčko pro FTA-ABS se oplachuje v destilované vodě v kyvetě

    Sklíčko pro FTA-ABS se oplachuje v destilované vodě v kyvetě

    - Osušte sklíčko při pokojové teplotě nebo opatrně filtračním papírem

    - Po osušení pokryjte preparáty pufrovaným glycerolem tak, že kápnete 3 malé kapky a mezi každou kapkou uděláte pauzu, pak přiložíte krycí sklíčko tak, aby se zamezilo přístupu vzduchu

    Obrázek 9.36. Dokončování FTA-ABS - laborantka kape na sklíčko glycerol

    Dokončování FTA-ABS - laborantka kape na sklíčko glycerol

    Obrázek 9.37. FTA-ABS - laborantka opatrně překrývá podložní sklo krycím sklíčkem

    FTA-ABS - laborantka opatrně překrývá podložní sklo krycím sklíčkem

    Obrázek 9.38. FTA-ABS - krycí sklíčko se fixuje jemným stiskem

    FTA-ABS - krycí sklíčko se fixuje jemným stiskem

    - S odečtem se nemá otálet, má následovat do 2 hodin po dokončení reakce, nebo je nutné sklíčka chránit v ledničce ve vlhké komůrce před světlem a vyschnutím. Bez ztráty kvality fluorescence se mohou sklíčka uchovávat nejdéle 4 hodiny (Pospíšil 1981)

     

Odečítání výsledků

Ve fluorescenčním mikroskopu se při zvětšení 400x posuzuje intenzita fluorescence:

velmi silná fluorescence ++++

silná fluorescence +++

střední fluorescence ++

slabá fluorescence +

velmi slabá fluorescence ±

žádná fluorescence –

Odečítání je subjektivní a vyžaduje určitou zkušenost hodnotitele.

Obrázek 9.39. Příznačný modrý svit fluorescenčního mikroskopu

Příznačný modrý svit fluorescenčního mikroskopu

Interpretace:

Fluorescence na 4+, 3+ nebo 2+ ……………pozitivní

Fluorescence na 1+…….……………………..hraniční

Fluorescence na ± nebo žádná fluorescence…negativní

Obrázek 9.40. Pozitivní výsledek FTA-ABS - ostře zelená fluorescence spirálek treponemat

Pozitivní výsledek FTA-ABS - ostře zelená fluorescence spirálek treponemat

Obrázek 9.41. Negativní výsledek FTA-ABS (zeleně světélkují časté artefakty)

Negativní výsledek FTA-ABS (zeleně světélkují časté artefakty)

Odečítání kontrol:

Pozitivní kontrolní sérum zředěné

1:5 PBS...........................................................fluorescence 4+

1:5 sorbentem.................................................fluorescence 3+

 

Nespecificky pozitivní kontrolní sérum zředěné

1:5 PBS ...........................................................fluorescence 2+

1:5 sorbentem..................................................fluorescence žádná nebo nejistá

 

Kontroly složek reakce

sorbent.............................................................fluorescence žádná

samotný konjugát.............................................fluorescence žádná

 

 

ELISA

Imunoenzymatickým stanovením protilátek (ELISA) se dají zjišťovat protilátky proti různým antigenům T. p. pallidum, například vůči celým treponematům, nebo vůči antigenům rekombinantním (Schmidt 2000). Stanovovat se mohou protilátky třídy IgG, IgM, případně celkové protilátky (tedy obou tříd zároveň).

Stanovení celkových protilátek je poněkud výhodnější než pouhé stanovení IgG, poněvadž na počátku onemocnění mohou být po určitou dobu zachytitelné pouze protilátky ve třídě IgM (Larsen 1998). Pozoruje se také potlačení protilátkové odpovědi ve třídě IgG při včasném stanovení diagnózy a časné léčbě. Na druhé straně se protilátky IgM nemusí u dospělých vůbec zachytit a jejich detekce se pokládá za skutečně klíčovou především u dětí narozených luetičkám. Nález protitreponemových IgM u novorozenců či kojenců může být silným signálem vrozené syfilis (Sanchez 1989).

Výhodou reakce ELISA je to, že se dá snadno automatizovat a výstup je objektivní. Jiné treponemové reakce se odečítají subjektivně, ovšem některé (typicky TPHA) jsou levnější než ELISA (Schmidt 2000). V každém případě ale existuje trend využívat automatizace, protože to redukuje personální náklady laboratoře a automatizovatelné testy mají obvykle právě formát ELISA (Pope 1998, 2000).

Objevují se také snahy nahradit metodou ELISA jiné screeningové testy. ELISA IgG jako screeningový test, ať už samostatně, nebo v kombinaci s jinými sérologickými nástroji, studovali mnozí autoři (Pope 2000, Reisner 1997, Young 1992a). Popeová (2000) zjistila shodu MHA-TP (varianta TPHA) se Syphilis-G testem (ELISA) v 97,7% . Podobně v naší studii shoda TPHA s Captia SelectSyph-G činila 96,78 %. Celkově je hemaglutinace sice citlivější než ELISA, ale někteří autoři potvrdili, že detekce IgG metodou ELISA může hemaglutinaci při screeningu syfilis nahradit (Aktas 2005, Pope 2000, Young 1992a).

Naopak Lefevre (1990) screening metodou ELISA nedoporučil, protože zjistil, že izolovaně použitá ELISA (Captia Syphilis-G) nemusí být dostatečně citlivá u primární syfilis, kde zachytila jen 82 % infikovaných. V naší studii pacientů s diskordantními výsledky ELISA a TPHA však byli ELISA-negativní nejčastěji osoby s pozdní latentní syfilis. Žádný z pacientů s diskrepantními výsledky primární syfilis netrpěl a falešné negativity byly relativně vzácné (Woznicová 2007).

Pokud jde o nabídku komerčních diagnostických setů, je poměrně rozsáhlá. Výkonností souprav se zabývali mnozí autoři (Halling 1999, Pope 1998, Pope 2000, Schmidt 2000, Young 1998, Zrein 1995). Všechny testované sety jsou obvykle vysoce citlivé. Slabinou studií je ale často stanovení specificity, protože ji testují pouze u běžné populace (např. při screeningu v rámci prenatální péče, vyšetření dárců krve) (Reisner 1997, Young 1998, Zrein 1995). Někteří autoři proto doporučili využívat ke screeningu testy ve formátu ELISA až poté, co budou shromážděna data týkající se specificity u latentní syfilis a u rizikové populace (Schmidt 2000, Silleti1995).

Princip reakce

Specifické IgG nebo IgM se váží na antigeny T. p. pallidum v důlku mikrotitrační destičky testovací soupravy. Přítomnost protilátek navázaných na treponemata se prokáže reakcí konjugátu (protilátek proti hledaným protilátkám značených enzymem) se substrátem, což vede k vývoji barevné reakce v příslušném pozitivním (protilátky obsahujícím) důlku.

Chemikálie a spotřební materiál

Chemikálie potřebné pro vyšetření obsahuje diagnostická souprava, jejíž složení může být následující:

  1. destička potažená antigenem

  2. hraniční kontrola (sérum s velmi nízkou hladinou protilátek), buď v pracovním ředění, nebo lyofilizovaná

  3. negativní kontrola (sérum bez antitreponemových protilátek), buď v pracovním ředění, nebo lyofilizovaná

  4. pozitivní kontrola (sérum s antitreponemovými IgM či IgG), buď v pracovním ředění, nebo lyofilizovaná

  5. konjugát, buď v pracovním ředění, nebo lyofilizovaný

  6. ředící roztok – pufrovaný fyziologický roztok

  7. chromogen/substrát v pracovním ředění

  8. promývací roztok – např. 10-krát koncentrovaný pufrovaný fyziologický roztok

  9. zastavovací roztok – pozor, obsahuje kyselinu sírovou a má žíravé účinky

Zacházení s chemikáliemi odpovídá popisu pro FTA-ABS.

Spotřební materiál nutný pro tuto reakci představují jednorázové plastové špičky k pipetám, zkumavky 5 a 10 ml, ochranné rukavice, filtrační papír a lihový fix. Tyto drobnosti nebývají součástí soupravy.

Přístroje a pomocná zařízení

Ke zhotovení reakce ELISA používá laboratoř následující přístroje: promývačku, spektrofotometr (reader) pro mikrotitrační destičky s filtrem 450 nm, vortex, pipety pro dávkování objemů 5 μl, 10 μl, 25 μl, 100 μl, 200 μl a 1000 μl, laboratorní minutky a třepačku na mikrotitrační destičky.

Obrázek 9.42. Promývačka mikrotitračních destiček

Promývačka mikrotitračních destiček

Obrázek 9.43. Reader s vloženou mikrotitrační destičkou

Reader s vloženou mikrotitrační destičkou

Obrázek 9.44. Multikanálová pipeta

Multikanálová pipeta

Obrázek 9.45. Na hroty multikanálové pipety se nasazují plastové špičky

Na hroty multikanálové pipety se nasazují plastové špičky

Provedení ELISA

Pro stanovení IgM i IgG platí:

  1. Příprava reagencií

    Promývací roztok – nařeďte 1+ 9 destilovanou vodou, např. 5 ml koncentrovaného promývacího roztoku a 45 ml destilované vody. Konjugát a substrát jsou již v pracovním ředění a neředí se.

  2. Příprava séra a kontrol

    Sérum se ředí ředícím roztokem vzorků (tzv. diluent) 1 + 100 (tedy 10 μl vzorku a 1 ml ředícího roztoku), dobře se promíchá a ponechá nejméně 10 minut při pokojové teplotě. Kontroly se neředí.

  3. Vlastní zhotovení reakce

    Při stanovení IgM dávkujte kontroly a ředěné vzorky takto:

    A1 – blank (jamku ponechte prázdnou)

    B1 – 100 μl kalibrátoru

    C1 - 100 μl negativní kontroly

    D1 - 100 μl pozitivní kontroly a následující jamky - 100 μl vzorku

    Obrázek 9.46. ELISA - pipetování jednotlivých sér a kontrol

    ELISA - pipetování jednotlivých sér a kontrol

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě

    - Odsajte obsah jamek a 3krát důkladně promyjte pracovním promývacím roztokem

     

    Obrázek 9.47. ELISA - zbytková tekutina se po promytí vyklepe do buničiny

    ELISA - zbytková tekutina se po promytí vyklepe do buničiny

    - Do všech jamek vyjma A1 dávkujte 100 μl konjugátu

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě

    - Odsajte obsah jamek a třikrát důkladně promyjte pracovním promývacím roztokem

    - Do všech jamek dávkujte 100 μl chromogen/substrátu

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 15 minut při pokojové teplotě, ve tmě

    - Zastavte reakci přidáním 100 μl zastavovacího roztoku ve stejném pořadí a intervalech jako byl dodáván substrát

    - Změřte intenzitu zbarvení roztoků v jednotlivých jamkách na fotometru při 450 nm proti blanku A1, měření je nutno provést do 30 minut po zastavení reakce

    Obrázek 9.48. Společné součásti reakce ELISA (např. konjugát) se dávkují multikanálovou pipetou

    Společné součásti reakce ELISA (např. konjugát) se dávkují multikanálovou pipetou

    Obrázek 9.49. ELISA - laborantka používá multikanálovou pipetu

    ELISA - laborantka používá multikanálovou pipetu

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 15 minut při pokojové teplotě, ve tmě

    - Zastavte reakci přidáním 100 μl zastavovacího roztoku ve stejném pořadí a intervalech jako byl dodáván substrát

    - Změřte intenzitu zbarvení roztoků v jednotlivých jamkách na fotometru při 450 nm proti blanku A1, měření je nutno provést do 30 minut po zastavení reakce

     

    Při stanovení IgG dávkujte kontroly a ředěné vzorky takto:

    A1 – blank (jamku ponechte prázdnou)

    B1 – 100 μl kalibrátoru 2

    C1 - 100 μl negativní kontroly

    D1 - 100 μl pozitivní kontroly a

    Následující jamky - 100 μl vzorku

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě

    - Odsajte obsah jamek a 3krát důkladně promyjte pracovním promývacím roztokem

    - Do všech jamek vyjma A1 dávkujte 100 μl konjugátu

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě

    - Odsajte obsah jamek a třikrát důkladně promyjte pracovním promývacím roztokem

    - Do všech jamek dávkujte 100 μl chromogen/substrátu

    - Destičku přikryjte víčkem a inkubujte 15 minut při pokojové teplotě, ve tmě

    - Zastavte reakci přidáním 100 μl zastavovacího roztoku ve stejném pořadí a intervalech jako byl dodáván substrát

    - Změřte intenzitu zbarvení roztoků v jednotlivých jamkách na fotometru při 450 nm proti blanku A1, měření je nutno provést do 30 minut po zastavení reakce

    Obrázek 9.50. Automatický analyzátor - předností reakce ELISA je možnost automatizace

    Automatický analyzátor - předností reakce ELISA je možnost automatizace

    Obrázek 9.51. Detail útrob analyzátoru s vloženou destičkou

    Detail útrob analyzátoru s vloženou destičkou

Odečítání výsledků

Pro stanovení jak IgM, tak IgG platí: Pro každý hodnocený vzorek se stanoví index pozitivity (IP). IP se stanovuje tak, že se absorbance testovaného vzorku dělí průměrnou absorbancí hraniční kontroly (tzv. cut-off) naměřené v dané sérii vyšetření.

Interpretace získaných IP je následující:

< 1,0 ............................................negativní

> nebo = 1,0 .............................. pozitivní

Často se využívá také hodnocení, kdy hodnoty 0,9 - 1,1 jsou považovány za hraniční (někdy se používá výraz šedá zóna), < 0, 9 negativní a >1,1 pozitivní.

V hraničních případech se většinou doporučuje vyšetření zopakovat, podle situace i z nového odběru klinického materiálu. Hraniční výsledek vyšetření může být také důsledkem postupného poklesu protilátek během let po infekci. Ani vyšetření nového vzorku pak nemusí přinést jednoznačný výsledek.

Obrázek 9.52. Hotová ELISA - destička a výstup z readru

Hotová ELISA - destička a výstup z readru

Westernblot

Westernblot představuje molekulární charakterizaci humorální imunitní odpovědi na T. p. pallidum, protože umožňuje stanovit protilátky (IgM nebo IgG) specificky proti spektru treponemálních proteinů (Byrne 1992, Meyer 1994, Sanchez 1989).

Westernblot dokáže detekovat nízké hladiny protilátek v počátku infekce, kdy může být citlivější než FTA-ABS (Backhouse 2001). Zákoucká (2007) srovnávala dvanáct sérologickýchi metod (VDRL, TPPA, různé formáty ELISA a FTA, westernblot) a zjistila, že z porovnávaných metod je bez ohledu na fázi infekce stanovení IgG westernblotem nejcitlivější.

Klíčový je westernblot v průkazu kongenitální syfilis (Sanchez 1989, Meyer 1994, Schmitz 1994).

 

Obrázek 9.53. Poloha charakteristických pruhů 15,5 kDa, 17 kDa a 47 kDa ve westernblotu

Poloha charakteristických pruhů 15,5 kDa, 17 kDa a 47 kDa ve westernblotu

 

Princip testu

Specifické IgG nebo IgM se váží na odpovídající antigeny T. p. pallidum na membráně westernblotu. Vazba se prokáže reakcí konjugátu (protilátek proti hledaným protilátkám značených enzymem) se substrátem, což vede k vývoji barevných pruhů v místech specifických antigenů.

Chemikálie a spotřební materiál

Chemikálie potřebné pro vyšetření jsou obsaženy v diagnostické soupravě, jejíž složení může být následující:

  1. promývací roztok, 25x koncentrovaný

  2. prášková složka pro přípravu ředicího pufru

  3. konjugát

  4. hraniční kontrola

  5. substrát

Spotřebním materiálem, který má mít laboratoř při zhotovování westernblotu po ruce, jsou jednorázové plastové špičky k pipetám, ochranné rukavice, inkubační vaničky pro westernbloty, filtrační papír, lihový fix, buničitá vata a izolepa.

Obrázek 9.54. Detail inkubační vaničky s vloženými bloty

Detail inkubační vaničky s vloženými bloty

Obrázek 9.55. Vaničky různých rozměrů pro westernblot

Vaničky různých rozměrů pro westernblot

Přístroje a pomocná zařízení

Používají se následující přístroje a pomocná zařízení: Třepačka vaniček, pipety dávkující 10 µl, 20 μl a 2 ml, dávkovač, laboratorní minutky, odměrné válce 1000 ml a 100 ml, pinzeta a nůžky.

Provedení westernblotu

  1. Příprava reagencií

    Ředící a promývací roztok: Promývací roztok ředíme 1:25 (40 ml promývacího pufru + 960 ml destilované vody).

    Ředící pufr sér: Dobře promícháme práškovou složku pro přípravu ředicího pufru se 100 ml naředěného promývacího roztoku. Dbáme, aby se prášek v roztoku zcela rozpustil. Do dalšího použití se roztok skladuje při 2 - 8 °C, vydrží 2 týdny.

    Konjugát: Konjugát je jiný pro IgM a IgG, ředíme 1 + 100 dílů promývacího roztoku. Ředěním se připravuje vždy právě jen takové množství konjugátu, které se spotřebuje do reakce. Pro 1 sérum či každou kontrolu je třeba mít 1,5 ml naředěného konjugátu. Nenaředěný, rekonstituovaný konjugát se skladuje při 2 - 8 °C.

    Hraniční (cut off) kontroly pro IgG a IgM jsou připravené k použití.

    Substrát je připraven k použití a je stejný pro IgM a IgG.

     

    Obrázek 9.56. Pracovní místo a pomůcky připravené pro zhotovení westernblotu

    Pracovní místo a pomůcky připravené pro zhotovení westernblotu

  2. Vlastní zhotovení reakce

    - Pinzetou se opatrně vyjme potřebný počet pásků (westernblotů) z tuby či bločku

    - Každý blot se umístí samostatně do jednoho řádku inkubační vaničky, laborant se při manipulaci nesmí dotýkat pásků rukama

    - Každý řádek vaničky se musí patřičně označit, 1. a 2. řádek jako kontroly, další řádky popsat identifikačními čísly vyšetřovaných vzorků

    Obrázek 9.57. Westernblot - pinzetou se opatrně vyjme potřebný počet blotů

    Westernblot - pinzetou se opatrně vyjme potřebný počet blotů

    Obrázek 9.58. Westernblot - každý proužek se umístí do jednoho řádku inkubační vaničky

    Westernblot - každý proužek se umístí do jednoho řádku inkubační vaničky

    - Každý blot se navlhčí přelitím 1,5 ml ředicího pufru sér, zkontroluje se, že je blot zcela ponořen a nechá se 1 min. nasáknout za protřepávání na třepačce

    Obrázek 9.59. Westernblot - přelévání blotů ředícím pufrem pomocí dávkovače

    Westernblot - přelévání blotů ředícím pufrem pomocí dávkovače


    - Přidá se 100 µl hraniční kontroly a za pomalého protřepávání se přidává 15 µl každého vzorku

    Obrázek 9.60. Pipetování séra

    Pipetování séra


     

    - Inkubuje se na třepačce 30 minut a pak se z řádků odstraní naředěný materiál

    - Přidá se 1,5 ml promývacího roztoku a promývá na třepačce 5 min., promývání se 3x zopakuje

    - Napipetuje se 1,5 ml připraveného konjugátu a inkubuje 30 min. na třepačce při pomalém chodu

    - Odstraní se konjugát z vaničky, přidá se 1,5 ml promývacího roztoku a promývá se na třepačce 5 minut, promývání se 3x zopakuje

    - Odstraní se promývací roztok a přidá se 1,5 ml destilované vody do každého řádku vaničky

    - Nechá se třepat na třepačce 1 minutu, 3x se zopakuje, pak se z řádků dokonale odstraní destilovaná voda

    - Přidá se 1,5 ml vyvíjecího roztoku do každého řádku vaničky

    - Inkubuje se na třepačce 10 +/- 3 min., až se zřetelně vyvine pozitivní reakce na blotu s hraniční kontrolou

    - Reakce se zastaví trojnásobným promytím 1,5 ml destilované vody

    - Pinzetou se opatrně vyjmou bloty z vaničky a položí na filtrační papír popsaný podle označení vzorků

    - Bloty se přelepí izolepou a nechají se oschnout

    Obrázek 9.61. Westernblot - promývání blotů na třepačce

    Westernblot - promývání blotů na třepačce

    Obrázek 9.62. Westernblot - zastavování reakce destilovanou vodou

    Westernblot - zastavování reakce destilovanou vodou

    Obrázek 9.63. Příprava westernblotů pro odečítání

    Příprava westernblotů pro odečítání

Odečítání výsledků

Každý strip se pečlivě srovná se vzorem hraniční reakce (tzv. cut off). Kritériem je intenzita pruhu (bandu) 47 kDa, který musí vykazovat slabou intenzitu reakce. Pruhy s intenzitou nižší než hraniční kontrola (47 kDa) se nehodnotí. Pruhy stejné intenzity jako 47 kDa se hodnotí 1 bodem, pruhy s vyšší intenzitou 2 body. Bodová hodnocení pro každý westernblot se sečtou.

Posuzují se tyto pruhy: TpN 47, TmpA, TpN 17, TpN 15. Jejich poloha je vyznačena na membráně stripu.

Hodnocení pro IgG: méně než 4 body - negativní, 4 body - hraniční, více než 4 body pozitivní.

Hodnocení pro IgM: méně než 2 body - negativní, 2 body - hraniční, více než 2 body pozitivní.

U jiných souprav se uplatňuje jednodušší hodnocení - výskyt všech tří vysoce specifických pruhů TpN 47, TpN 17 a TpN 15 značí pozitivní výsledek, výskyt pouze jednoho či dvou pruhů je výsledek hraniční, nepřitomnost specifických pruhů znamená negativní výsledek. V praxi se můžeme setkat ještě s dalšími způsoby stanovení výsledků. Někdy se do hodnocení zahrnuje také pruh TmpA.

 

Obrázek 9.64. Výukové video

Výukové video

 

Obrázek 9.65. Hotové westernbloty připravené k odečítání výsledků

Hotové westernbloty připravené k odečítání výsledků

Obrázek 9.66. Westernblot - detail proužků zachycuje různou intenzitu reakce

Westernblot - detail proužků zachycuje různou intenzitu reakce

Další treponemové reakce

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) je obdoba TPHA, kde jako nosič specifických antigenů nefiguruje krvinka, ale želatinová částice. Výrobek má proto vyšší stabilitu a snad i specificitu.

Imunochromatografické testy stanovují celkové protilátky vůči antigenům naneseným na nitrocelulózovou membránu, znázorní se jako barevný pruh. Výhodou je rychlost stanovení. Mají proto opodstatnění pro orientační diagnostiku v terénu, nebo v neodkladných situacích pro získání rychlého přehledu. Jejich použití představuje určité riziko u velmi časných případů syfilis, nebo naopak po letech od počátku onemocnění, kdy mohou selhat.

FTA-ABS IgM je variantou FTA-ABS, ale stanovuje odděleně IgM. Citlivost reakce není uspokojivá kvůli kompetici IgG o antigeny treponemat (Johnston 1972, Zákoucká 2007).

19S IgM FTA-ABS je citlivý a specifický test, ale jeho provedení je náročné kvůli nutnosti frakcionovat sérum, což na druhé straně zvyšuje specificitu reakce. Nevýhodou je však podobně jako u FTA-ABS IgM relativně malá citlivost testu (Stoll 1993).

19S IgM SPHA (19S solid phase hemadsorption) je test, který zachycuje selektivně IgM (patří mezi tzv. capture reakce), přičemž nosičem antigenu jsou krvinky, nebo mikroskopické částice. Test umožňuje kvantifikaci protilátkové odpovědi a sledování změn titru v průběhu dispenzární péče (Zákoucká 2001).

Průběžně se objevují i další formáty testů (immunoline assay, chemiluminiscenční testy apod.).